Для того, чтобы оценить ресурс, необходимо авторизоваться.
Практикум содержит работы, которые позволяют студентам приобрести навыки работы с микроорганизмами, изучить их морфологию, культуральные, физиологические и биохимические свойства, освоить методы микробиологического исследования объектов окружающей среды. Предназначено для студентов специальностей «Биология» (011600), «Экология» (013100), «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов» (320700).
Общее количество бактерий можно определить путем подсчета клеток в окрашенном мазке, приготовленном из точно отмеренного объема бактериальной взвеси. Зная площадь поля зрения микроскопа и площадь мазка, можно подсчитать, какое количество бактерий было в мазке и соответствующем объеме среды. Для удобства можно пользоваться стандартными предметными стеклами с выгравированными делениями в счетных камерах. Подсчет бактерий в счетных камерах производится в темном поле зрения (обычном микроскопе) или при помощи фазовоконтрастной установки. Метод Фихмана и Брауде Бактериальная взвесь перед подсчетом клеток в счетной камере должна быть тщательно перемешана (на электромагнитной мешалке). После этого ее в несколько раз (20–30) разводят в физиологическом растворе или в стерильной водопроводной воде. Затем этой взвесью заполняют счетную камеру Бюргера В, глубина которой составляет 0,01 мм. Подсчет количества бактерий следует производить не менее чем в десяти камерах. В каждой камере необходимо подсчитать количество клеток в 25 малых квадратах, расположенных по диагонали. Полученные результаты обрабатываются по методу вариационной статистики с целью определения величины стандартного отклонения и средней ошибки. Подсчет гипертрофированных клеток Подсчет живых клеток можно произвести также при помощи мочевины, внесенной непосредственно в исследуемую суспензию. Гипертрофированные клетки вследствие воздействия мочевины легко различаются при просмотре окрашенных препаратов. Подсчет количества живых клеток методом разведения Наиболее распространенным методом определения количества живых клеток в культуре является метод посева соответственно разведенной в определенном объеме бактериальной культуры на плотную питательную среду в чашки Петри. Бактериальную суспензию разводят в стерильной водопроводной воде или в физиологическом растворе. При посеве взвеси на поверхность питательного агара посевной материал тщательно и равномерно распределяют шпателем по поверхности агаровой пластинки. При посеве в глубину (среды) в стерильную чашку вносят вначале 1 мл посевного материала, заливают ее расплавленным и остуженным до 45–50° С агаром и размешивают содержимое чашки легким покачиванием. Засеянные чашки оставляют в термостате при оптимальной для данного вида температуре. Затем подсчитывают количество выросших колоний. Сделав соответствующие расчеты, определяют число живых клеток в 1 мл растущей культуры. Метод Сатианарьяна и др. В чашки Петри с агаром при помощи микропипетки наносят по пять капель объемом по 0,01 мл из различных разведений микробной взвеси. После инкубации подсчитывают колонии, выросшие на месте нанесения каждой капли, умножают на 20 и на величину разведения и определяют число микробов в 1 мл исследуемой суспензии. Посевы из серии разведений дают правильные геометрические ряды чисел колоний. При исследовании аэробных микроорганизмов в чистых и смешанных культурах метод более удобен, быстр и экономичен, чем определение количества бактерий методом разливок, хотя при этом возможны такие же ошибки, как и при использовании метода разливок. Во-первых, источником ошибки является то, что образование колоний происходит не от одной, а от двух и более скопившихся клеток, во-вторых, ошибки могут быть связаны с различными неточностями при приготовлении разведения. Один из указанных недостатков может быть устранен при использовании метода Поуэлла (1956), согласно которому посев разведенной культуры следует производить на целлофановую мембрану с нанесенной на ее поверхности сеткой с делениями. Мембрану помещают на поверхности питательной среды и сразу же после посева (при микроскопировании) определяют количество единичных клеток в квадратах и их скопления. То же проделывают через 6 час инкубации. Разницу в количестве клеточных скоплений принимают в основу подсчета живых клеток. Метод предельных разведений Подсчет жизнеспособных клеток также можно произвести по методу предельных разведений при помощи посева определенного объема различных разведений в ряд пробирок с жидкой питательной средой. При наличии роста в одних пробирках и отсутствии его в пробирках с большим разведением внесенного посевного материала судят об исходном содержании клеток в 1 мл среды, допуская, что в последнюю пробирку, в которой обнаруживался рост бактерий, была высеяна одна жизнеспособная клетка. Этот метод может давать большие вариации, поэтому нужно пользоваться большим числом повторностей.
Определите количество клеток в поле зрения
Подробное решение лабораторная работа 2 по биологии для учащихся 9 класса, авторов И. Н. Пономарева, О. А. Корнилова, Н. М. Чернова 2016
Гдз рабочая тетрадь по Биологии за 9 класс можно найти тут
Рассмотрение микропрепаратов с делящимися клетками растения.
Цель работы: изучение делящихся клеток.
Оборудование: микроскоп, готовые микропрепараты с делящимися клетками кончика корня.
— Рассмотрите микропрепарат сначала при малом увеличении, затем при большом увеличении.
— Найдите на микропрепарате делящиеся клетки. Определите, какие фазы деления клеток зафиксированы на препарате.
— Сосчитайте количество делящихся клеток, которые находятся в поле зрения (не сдвигая микропрепарат под микроскопом).
— Сосчитайте количество неделящихся клеток, находящихся в поле зрения под микроскопом.
— Зарисуйте делящиеся клетки в таблице по образцу:
Биология Лабораторная работа №2 Рассмотрение микропрепаратов с делящимися клетками растения
bio.na5bal.ru > Документы > Лабораторная работа
Биология
Лабораторная работа №2
Рассмотрение микропрепаратов с делящимися клетками растения
Цель работы: изучение делящихся клеток.
Оборудование: микроскоп, готовые микропрепараты с делящимися клетками кончика корня.
Методические рекомендации по определению количества микробных клеток в исследуемом материале
Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/132)
Настоящие Методические рекомендации регламентируют определение количества микробных клеток, для диагностических ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских организаций и высших учебных заведений ветеринарного профиля при диагностике болезней животных (включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел.
Определять количество клеток можно в счетных камерах, в окрашенных препаратах. Эти методы особенно ценны, если отсутствуют показатели применительно данного микроорганизма, позволяющие использовать косвенный подсчет при помощи стандарта мутности, нефелометрии.
Определение общего количества микробных клеток в счетных камерах
Обычно используют камеру Горяева-Тома, которая представляет толстое предметное стекло, разделенное бороздами. В центральной части стекла есть сетка, площадью одного большого квадрата составляет 1/25 мм 2 , малого – 1/400 мм 2 . Площадка с сеткой находятся на 0,1 мм ниже остальных частей стекла (глубина камеры). В ходе работы сначала притирают шлифованное покровное стекло со стороны камеры до появления колец Ньютона. Исследуемую суспензию бактерий вносят через бороздку камеры пипеткой. Подсчет начинают через 3-5 минут после заполнения камеры. Это время необходимо для оседания клеток, когда они окажутся в одной плоскости. Подвижные или патогенные клетки предварительно убивают формалином или нагреванием. Рассматривают содержимое камеры в микроскоп, используя объектив х8, х40, т.е. можно обнаруживать достаточно крупные объекты — дрожжи, конидии, грибы. При использовании данной камеры работать с иммерсионным объективом нельзя, т.к. его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры.
Камера Хауксли позволяет работать с иммерсией. Подсчет неокрашенных микробов можно провести с помощью фазово-контрастного или темнопольного микроскопа.
Сначала проводят предварительный подсчет клеток. Если концентрация клеток чрезмерно высока (более 3х10 8 мл), то суспензию разводят раствором Норриса-Пацелла: 1000 мл воды, 5 мл 40%-ного формальдегида, устанавливают рН с помощью Nа2НР04 на уровне 7,2-7,4. Затем к пробе добавляют равное количество NН4С1, что в результате вызывает ги бель клеток, появление у них положительного заряда, и, как следствие, они адсорбируются на стекле.
Рекомендуется подсчитывать не менее 600 клеток в 10 больших или 20 малых квадратах, повторяя подсчет 3-4 раза. Количество клеток рекомендуется подсчитывать всегда в одних и тех же квадратах, например 4-х угловых и в квадратах по диагонали. Количество клеток определяют по формуле:
М= (а · 10 3 /h)·n, где
М — количество бактерий в 1 мл;
а — среднее число клеток в квадрате;
h — высота камеры в мм;
S — площадь квадрата сетки в мм 2 ;
10 3 — коэффициент перевода см 3 в мм 3 ;
n — разведение исследуемой суспензии.
Определение общего количества клеток в фиксированных окрашенных мазках (метод Брида)
Хорошо обезжиренное предметное стекло кладут на листок миллиметровой бумаги, на которой отмечен квадрат площадью 1см 2 (или более). Смешивают равные объемы взвеси бактерий и 0,03-0,1% водного агара с температурой 45°С. Микропипеткой на стекло наносят точно измеренный объем взвесей, например 0,01 мл, равномерно распределяют по отмеченной площади, подсушивают, фиксируют этанолом (96°) 10-20 минут, окрашивают 1-2 минуты фуксином Циля, промывают, подсушивают, микроскопируют.
Используют окулярную сетку, расположенную между собирательной и глазной линзой. Подсчитывают клетки в 50-100 полях зрения, но не менее 600 клеток, и определяют их содержание в 1 мл взвеси по формуле:
М — количество бактерий в 1 мл взвеси;
а — среднее число клеток в квадрате окулярной сетки;
s — площадь квадрата окулярной сетки в 1 мм 2 ;
V — объем взвеси бактерий;
S — площадь мазка в мкм 2 ;
n — разведение взвеси бактерий.
Определение количества клеток нефелометрическим методом
Метод пригоден при работе с бактериями, которые растут с равномерным помутнением среды без образования пленок или каких-либо других скоплений клеток. Количество света, рассеиваемого суспензией бактерий, пропорционально их концентрации (числу клеток) или средней длине бактерий. Зависимость между интенсивностью падающего света «Io» и прошедшего света «Т», описывается формулой:
I = Io· 10 — elc , где
e — коэффициент экстинкции;
l — толщина слоя суспензии;
с— концентрация бактерий, откуда следует, что lg (I/Io) = -elc или lg (Io/I) = elc.
Величина lg (I/Io) называется оптической плотностью или экстинкцией. Изменение оптической плотности, вызываемое изменением концентрации, зависит от толщины слоя суспензии (l) и свойств суспензии, характеризуемых коэффициентом e, который различен для бактерий разных видов, поэтому для каждого вида бактерий необходимо строить свою калибровочную кривую зависимости между оптической плотностью и концентрацией бактерий.
Питательная среда, на которой выращивают микроорганизмы, должна быть оптически прозрачной. Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют при помощи спектрофотометра или фо-тоэлектроколориметра, обычно с длиной волны 540-650 нм. Для измерений культур в МПБ подходит красный фильтр. Суспензии большой плотности следует разводить средой. При построении калибровочной кривой измеряют величину светорассеивания суспензий с различным содержанием клеток. Для этого делают серию разведений хорошо перемешанной суспензии. Интервалы разведений должны быть не очень большими. Для калибровки в абсолютных единицах необходимо точно измерить количество клеток в исходной суспензии, поскольку именно этот этап работы определяет точность результатов в дальнейшем. Измеряют величину светорассивания суспензий с различным содержанием клеток, полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат коэффициент экстинкции, а на оси абсцисс — количество клеток в 1 мл суспензии. В последующем, при помощи калибровочной кривой, измеряя оптическую плотность взвеси данного вида бактерий, устанавливают концентрацию клеток.
В лабораториях широко используют так называемый «стандарт мутности», выпускаемый Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л А.Тарасевича. Стандарт состоит из трех запаянных пробирок-эталонов на 5, 10, 20 единиц мутности. Мутность стандарта на 10 ед. соответствует следующим концентрациям бактерий: кишечная группа — 0,93·10 9 мк/мл; бруцеллы — 1,7·10 9 мк/мл; бордетеллы — 11·10 9 мк/мл; возбудитель туляремии — 5·10 9 мк/мл. Ход работы со стандартом мутности следующий. Например, в пробирку внесли 0,1 мл взвеси бактерий кишечной группы неизвестной концентрации. Для уравнивания оптической плотности исследуемой взвеси со стандартом мутности на 10 ед. в пробирку пришлось добавить 0,9 мл физиологического раствора. Сравнение оптической плотности (мутности) стандарта и пробирки с исследуемой взвесью проводят, рассматривая через них невооруженным глазом шрифт на специальной шрифтовой таблице, стоя спиной к свету. В данном примере исследуемую взвесь пришлось развести для уравнивания со стандартом в 10 раз, следовательно, в ней содержится 0,93·10 9 мк/мл · 10 =0,93·10 10 мк/мл.
При работе с бактериями, для которых нет данных о содержании микробных клеток применительно «стандарта мутности», необходимо методом прямого счета определить их количество во взвеси, соответствующей по оптической плотности, например, стандарту на 10 ед., и в последующем Пользоваться этими показателями.
В случае необходимости можно приготовить стандарт мутности МсFarland, предварительно проверив с помощью отечественного стандарта, какой концентрации бактериальных клеток данного вида соответствует стандарт МсFarland. В запаянных пробирках этот стандарт пригоден для использования в течение 3 месяцев хранения в темноте при комнатной температуре.
Приготовление стандарта мутности по методу МсFarland. Раствор А: 1,75 г ВаС12·2 Н2О растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор Б: 1,0 мл. Н2SO4 (уд. вес 1,84) растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Основной раствор: смешивают 0,5 мл раствора А и 99,5 мл раствора В, перемешивают, разливают по 4-6 мл в пробирки и запаивают.
Определение количества живых бактерий
Метод посева исследуемой взвеси бактерий на поверхность агара Готовят десятикратные разведения исследуемой взвеси бактерий. По 0,1 мл разведений культуры наносят на поверхность агара в чашках Петри, равномерно распределяют шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют, подсчитывают количество клеток в 1 мл взвеси по формуле:
М — количество клеток в 1 мл взвеси бактерий;
а — среднее число колоний, выросших при посеве данного разведения;
V — объем посеянной взвеси бактерий;
10 n — коэффициент разведения.
Для получения достаточно точных воспроизводимых результатов необходимо при работе выполнять ряд требований.
— В ходе опыта использовать один коэффициент разведения, например 10 -1 , путем добавления 0,1 мл культуры к 0,9 мл раствора.
— При работе с вегетативными клетками (из-за их адсорбции на стеклах пипетки) для каждого разведения использовать отдельную пипетку одного и того же объема и класса.
— Агар перед разливом в чашки Петри охлаждают до 45-50°С, что дает мало конденсата. Ели на поверхности агара возникают пузыри при разливе, то их убирают, направляя пламя горелки на агар. Агар подсушивают в чашках Петри при комнатной температуре в течение12-24часов.
— На количество выросших колоний влияет разбавитель. Разбавление водой или физиологическим раствором, с некоторым интервалом до посева (15 мин), может привести к двукратному уменьшению числа клеток. Желательным является использование забуференного сбалансированного солевого раствора, содержащего белок. Например, 0,01% желатины.
— Разведение готовят таким образом, чтобы имелись чашки Петри с оптимальным для подсчета количеством колоний (100-200 на чашку), хотя возможен подсчет в диапазоне 30-300 колоний.
— Не следует водить шпателем по поверхности агара после того, как суспензия уже всосалась, т.к это приводит к большому разбросу результатов.
Капельный метод посева взвеси бактерий на поверхность агара
Метод позволяет на одной чашке Петри проверить широкий диапазон разведений взвеси бактерий, что существенно при отсутствии каких-либо ориентировочных сведений о концентрации клеток. Метод желательно не использовать для определения количества быстро делящихся клеток, т.к. деление может произойти раньше, чем капля с бактериями адсорбируется агаром.
Разведения исследуемой взвеси бактерий отбирают специально калиброванной пипеткой и на поверхность хорошо подсушенного агара наносят капли взвеси строго определенного объема, например 0,02 мл. Пипетку при этом держат строго вертикально. Капли не растирают, можно только несколько увеличить их площадь, слегка покачивая чашку Петри. Посевы инкубируют и затем определяют количество выросших колоний. Калибровочные пипетки делают из стальных трубок или из стекла (пастеровская пипетка). В последнем случае пипетку вставляют в шаблон для калибровки проволоки, наносят напильником метку в месте контакта с шаблоном, затем делают надпил и отламывают кончик. Пригодны пипетки со строго вертикальным относительно оси пипетки разломом. Пипетки с наружным диаметром 1 мм дают капли объемом 0,02 мл. Объем капли строго пропорционален наружному диаметру пипетки.
Метод посева в многослойный агар
В чашку Петри наливают агаровую среду (1,5% агара) в количестве, дающем толщину слоя 0,4 см. В предварительно нагретые до 45°С пробирки вносят по 2,5 мл расплавленной 0,7%-ной агаровой среды, делают разведения исследуемой культуры, согласно вышеизложенным требованиям. На наружной поверхности пробирки с агаром делают отметину карандашом, и в эту зону на внутреннюю поверхность пробирки наносят 0,1 мл разведенной пробы.
Определение количества живых клеток методом предельных разведений в жидкой питательной среде
Используют для определения количества бактерий, плохо растущих или не растущих на плотных питательных средах. Разведения исследуемой взвеси бактерий осуществляют как было описано выше. В пробирки наливают одинаковые объемы питательной среды. Посев производят из каждого разведения на 2-5 параллельных пробирок с питательной средой. Посевная доза должна быть во всех случаях одинаковой, например 1 мл. Посевы инкубируют столько времени, сколько необходимо для роста данного микроорганизма и учитывают наличие роста в пробирках по общепринятым критериям. При этом исходят из положения, что в пробирках, где нет роста, не было внесено ни одной микробной клетки.
Концентрация клеток определяется методом наиболее вероятных чисел, заключающемся в математической оценке вероятности присутствия жизнеспособных клеток в серийных разведениях, в которых уже не регистрируется рост. Разведение клеток подчиняется формуле Пуассона и среднее число клеток в разведении, где нет роста, вычисляют по формуле:
m — среднее, Р — отношение количества пробирок, где нет роста, к общему числу пробирок. Далее среднее умножают на фактор разбавления и объем инокулята, который дает заметный рост культуры. Для облегчения работы составлены специальные таблицы, при помощи которых можно, не прибегая к расчетам, определить наиболее вероятное число бактерий при параллельном засеве 2, 3, 4 и 5 пробирок (табл. 1).
Первая цифра слева в числовой характеристике показывает число пробирок в последнем разведении всех параллельных посевов, посев из которых дает рост во всех пробирках. Две следующие цифры показывают число пробирок, где есть рост из двух последних разведений. После учета результатов составляют числовую характеристику и по таблице 1 находят наиболее вероятное число бактерий, соответствующее этому значению числовой характеристики. Далее это количество клеток умножают на разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.
Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии
Числовая характеристика
Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе
Числовая характеристика
Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе
Числовая характеристика
Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе
2
3
4
5
2
3
4
5
2
3
4
5
000
0,0
0,0
0,0
0,0
222
110,0
3,5
2,0
1,4
433
—
—
30,0
—
001
0,5
0,3
0,2
0,2
223
—
4,0
—
—
434
—
—
35,0
—
002
—
—
0,5
0,4
230
—
3,0
1,7
1,2
440
—
—
25,0
3,5
003
—
—
0,7
—
231
—
3,5
2,0
1,4
441
—
—
40,0
4,0
010
0,5
0,3
0,2
0,2
232
—
4,0
—
—
442
—
—
70,0
—
011
0,9
0,6
0,5
0,4
240
—
—
2,0
1,4
443
—
—
140,0
—
012
—
—
0,7
0,6
241
—
—
3,0
—
444
—
—
160,0
—
013
—
—
0,9
—
300
—
2,5
1,1
0,8
450
—
—
—
4,0
020
0,9
0,6
0,5
0,4
301
—
4,0
1,6
1,1
451
—
—
—
5,0
021
—
—
0,7
0,6
302
—
6,5
2,0
1,4
500
—
—
—
2,5
022
—
—
0,9
—
303
—
—
2,5
—
501
—
—
—
3,0
030
—
—
0,7
0,6
310
—
4,5
1,6
1,1
502
—
—
—
4,0
031
—
—
0,9
—
311
—
7,5
2,0
1,4
503
—
—
—
6,0
040
—
—
0,9
—
312
—
11,5
3,0
1,7
504
—
—
—
7,5
041
—
—
1,2
—
313
—
16,5
3,5
2,0
510
—
—
—
3,5
100
0,6
0,4
0,3
0,2
320
—
9,5
2,0
1,4
511
—
—
—
4,5
101
1,2
0,7
0,5
0,4
321
—
15,0
3,0
1,7
512
—
—
—
6,0
102
—
1,1
0,8
0,6
322
—
20,0
3,5
2,0
513
—
—
—
8,5
103
—
—
1,0
0,8
323
—
20,0
3,5
2,0
513
—
—
—
8,5
110
1,3
0,7
0,5
0,4
330
—
25,0
3,0
1,7
521
—
—
—
7,0
111
2,0
1,1
0,8
0,8
331
—
45,0
3,5
2,0
522
—
—
—
9,5
112
—
—
1,1
0,8
332
—
110,0
4,0
—
523
—
—
—
12,0
113
—
—
1,3
—
333
—
140,0
5,0
—
524
—
—
—
15,0
120
2,0
1,1
0,8
0,6
340
—
—
3,5
2,0
525
—
—
—
17,5
121
3,0
1,5
1,1
0,8
341
—
—
4,5
2,5
530
—
—
—
8,0
122
—
—
1,3
1,0
350
—
—
—
2,5
531
—
—
—
11,0
123
—
—
1,6
—
400
—
—
2,5
1,3
532
—
—
—
14,0
130
—
1,6
1,1
0,8
401
—
—
3,5
1,7
533
—
—
—
17,5
131
—
—
1,4
1,0
402
—
—
5,0
2,0
534
—
—
—
20,0
132
—
—
1,6
—
403
—
—
7,0
2,5
535
—
—
—
25,0
140
—
—
1,4
1,1
410
—
—
3,5
1,7
540
—
—
—
13,0
141
—
—
1,7
—
411
—
—
5,5
2,0
541
—
—
—
17,0
200
2,5
0,9
0,6
0,5
412
—
—
8,0
2,5
542
—
—
—
25,0
201
5,0
0,4
0,9
0,7
413
—
—
11,0
—
543
—
—
—
30,0
202
—
2,0
1,2
0,9
414
—
—
14,0
—
544
—
—
—
35,0
203
—
—
1,6
1,2
420
—
—
6,0
2,0
545
—
—
—
45,0
210
6,0
1,5
0,9
0,7
421
—
—
9,5
2,5
550
—
—
—
25,0
211
13,0
2,0
1,3
0,9
422
—
—
17,0
—
551
—
—
—
35,0
212
20,0
3,0
1,6
1,2
423
—
—
13,0
3,0
552
—
—
—
60,0
213
—
—
2,0
—
424
—
—
20,0
—
553
—
—
—
90,0
220
25,0
2,0
1,3
0,9
430
—
—
11,5
1,5
554
—
—
—
100,0
221
70,0
3,0
1,6
1,2
431
—
—
16,5
3,0
555
—
—
—
180,0
432
—
—
20,0
4,0
—
—
—
—
Пример определения количества бактериальных клеток
Определение количества клеток с помощью микроскопа.
Любые студенческие работы — ДОРОГО!
100 р бонус за первый заказ
Количеству клеток в единице объема — титр клеток (или фаговых частиц).Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, намембранных фильтрах).
Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского–Брида)Преимущество: фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются.Техника: а) на хорошо обезжиренном предметном стекле маркером рисуют прямоугольник строго известной площади (2, 4 или 6 см2), б) на стекло в прямоугольник микропипеткой (или автоматической
пипеткой) наносят определенный объем суспензии клеток (0,01; 0,02 или 0,03 мл), в) суспензию равномерно распределяют петлей по всей площади прямоугольника, г) препарат высушивают на воздухе и фиксируют 15 мин 96 % этанолом, д) проводят окрашивание фуксином Циля 1 – 2 мин,
е) краситель сливают, препарат промывают водой, последовательно погружая стекло в 5 – 6 стаканов с водой) и высушивают на воздухе.Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами.Для получения достоверных результатов клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50 – 100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.
М – количество кл-ок в 1 мл; А – среднее число кл-к в квадрате
окулярной сетки (поле зрения); s и S – площадь квадрата окулярной
сетки (поля зрения) и приготовленного мазка в мкм2 соответственно;
V – объем нанесенной на стекло суспензии в мл; n – разведение.
2. Подсчет клеток на мембранных фильтрах
Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате
фильтрации определенного объема исследуемой пробы с окрашиванием и подсчетом в микроскопе.
С помощью мембранного фильтрования могут быть подсчитаны как жизнеспособные клетки микроорганизмов, так и определено общее количество клеток. Техника: 1. Собирают прибор для фильтрования под вакуумом. Дляэтого основание стерильного фильтродержателя вставляют в стериль-
ную колбу Бунзена, с помощью стерильного пинцета помещают в фильтродержатель стерильный фильтр и закрепляют зажимом. Отводной конец колбы Бунзена соединяют с вакуумным насосом.
2. Строго определенный объем исследуемого материала пропускают через мембранный фильтр, создавая с помощью насоса вакуум. 3. Фильтр, с осевшими клетками микроорганизмов, снимают сте-
рильным пинцетом и исследую в зависимости от целей эксперимента.
Проводят окрашивание фильтра 5 % раствором эритрозина в 5 % растворе фенола. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашкуПетри на фильтровальную бумагу, насыщенную красителем, чашкузакрывают и оставляют на 30 – 60 мин. Фильтр отмывают от красителя, последовательно перенося его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, насыщенной дистиллированной водой до тех пор, пока он не перестанет окрашивать влажную фильтровальную бумагу. Фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопирования. На предметное стекло накапывают иммерсион-
ное масло и помещают на него окрашенный мембранный фильтр таким образом, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и по-
крывают фильтр покровным стеклом.где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); s и F – площадь квадрата окулярнойсетки (поля зрения) и мембранного фильтра в мм2, соответственно;V – объем профильтрованной суспензии в мл; 106 – коэффициент пе-ревода мм2 в мкм2.
При подсчете колоний для увеличения контрастности мембранный фильтр с колониями окрашивают. Для этого поверхность фильтра, находящегося в чашке Петри, заливают 0,01 % водным раствором окса-
лата малахитового, который через 8 – 10 с сливают. При этом способе окрашивания колонии выглядят белыми или желтыми на фоне зеленого фильтра.
Метод подсчета клеток на мембранных фильтрах с помощью люминесцентного микроскопа заключается в концентрировании бактерий из исследуемого материала на нелюминесцирующий мембранный фильтр, флюорохромировании акридиновым оранжевым и подсчете клеток в специальном (люминесцентном) микроскопе. Этот метод удобен тем, что позволяет непосредственно подсчитать как общее количество клеток, так и количество жизнеспособных клеток. При окрашивании акридиновыми красителями жизнеспособные клетки имеют зеленую, а нежизнесобные (мертвые) – красную окраску.
Лабораторная работа № 2 по биологии на тему: «Рассмотрение микропрепаратов делящихся клеток». (9 класс)
за привлеченного слушателя на курсы профессиональной переподготовки
Оборудование: микроскоп; готовые микропрепараты с делящимися клетками кончика корня.
1. Рассмотрите микропрепарат сначала при малом увеличении, затем при большом увеличении.
2. Найдите на микропрепарате делящиеся клетки. Определите, какие фазы деления клеток зафиксированы на препарате.
3. Сосчитайте количество делящихся клеток, которые находятся в поле зрения (не сдвигая микропрепарат под микроскопом).
4. Сосчитайте количество неделящихся клеток, находящихся в поле зрения под микроскопом.
5. Зарисуйте делящиеся клетки в таблице по образцу:
Хромосомы перемещаются в середину клетки. Каждая из них состоит из двух хроматид, соединенных центромерой. Один конец нитей веретена прикреплен к центромерам.
Микротрубочки сокращаются, центромеры разъединяются и удаляются друг от друга. Хромосомы разделяются, и хроматиды расходятся к противоположным полюсам веретена.
Формируются новые ядра. Хромосомы в новых ядрах становятся тонкими, невидимыми в микроскоп. Вновь появляется ядрышко, и образуется оболочка ядра. Это последняя фаза деления ядра клетки.
ВНИМАНИЮ УЧИТЕЛЕЙ: хотите организовать и вести кружок по ментальной арифметике в своей школе? Спрос на данную методику постоянно растёт, а Вам для её освоения достаточно будет пройти один курс повышения квалификации (72 часа) прямо в Вашем личном кабинете на сайте «Инфоурок».
Пройдя курс Вы получите: — Удостоверение о повышении квалификации; — Подробный план уроков (150 стр.); — Задачник для обучающихся (83 стр.); — Вводную тетрадь «Знакомство со счетами и правилами»; — БЕСПЛАТНЫЙ доступ к CRM-системе, Личному кабинету для проведения занятий; — Возможность дополнительного источника дохода (до 60.000 руб. в месяц)!
Пройдите дистанционный курс «Ментальная арифметика» на проекте «Инфоурок»!
08.12.2016 389
08.12.2016 857
08.12.2016 411
08.12.2016 1662
08.12.2016 569
08.12.2016 188
08.12.2016 685
Не нашли то что искали?
Вам будут интересны эти курсы:
Все материалы, размещенные на сайте, созданы авторами сайта либо размещены пользователями сайта и представлены на сайте исключительно для ознакомления. Авторские права на материалы принадлежат их законным авторам. Частичное или полное копирование материалов сайта без письменного разрешения администрации сайта запрещено! Мнение редакции может не совпадать с точкой зрения авторов.
Ответственность за разрешение любых спорных моментов, касающихся самих материалов и их содержания, берут на себя пользователи, разместившие материал на сайте. Однако редакция сайта готова оказать всяческую поддержку в решении любых вопросов связанных с работой и содержанием сайта. Если Вы заметили, что на данном сайте незаконно используются материалы, сообщите об этом администрации сайта через форму обратной связи.
Количественный учет микроорганизмов
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Государственное образовательное учреждение
«Алтайский государственный технический университет
Бийский технологический институт (филиал)
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ
Методические рекомендации к лабораторным работам
по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология»,
«Общая биология и микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» всех форм обучения
Каменская, учет микроорганизмов: методические рекомендации к выполнению лабораторных работ по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология», «Общая биология и микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» всех форм обучения / , .
Алт. гос. тех. ун-т, БТИ. — Бийск.
Изд-во Алт. гос. тех. ун-та, 20с.
В настоящих методических рекомендациях рассматриваются основные методы определения количества клеток микроорганизмов. Приводятся лабораторные работы по определению общего количества микроорганизмов в сыром молоке, дрожжах. Описаны методы санитарно-бактериологического контроля оборудования, инвентаря и воздуха.
Рассмотрены и утверждены
на заседании кафедры
Протокол № 81 от 16.11.06
д. б.н., профессор (БПГУ им. )
ã БТИ АлтГТУ, 2007
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т. д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Так, многие методы, используемые для определения числа одноклеточных микроорганизмов, неприемлемы при подсчете многоклеточных (нитчатых, мицелиальных и других форм).
При оценке численности микроорганизмов, особенно в естественных субстратах (прежде всего в почве), необходимо помнить, что их клетки часто находятся в прикрепленном (адгезированном) состоянии или в виде микроколоний. Поэтому перед началом подсчета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (десорбировать). Выбор метода десорбции (механическое перемешивание суспензии клеток, растирание, обработка ультразвуком, применение поверхностно-активных веществ и т. д.) определяется особенностями исследуемого субстрата.
Точность любого метода определения числа микроорганизмов ограничена ошибкой метода, которая возникает вследствие случайного распределения клеток в суспензии и является результатом ограниченного числа подсчитываемых клеток, а также связана с техническими ошибками, т. е. неточностью в приготовлении разведений, неправильным монтажом камеры, повторным учетом одной и той же клетки (колонии) и т. д. Ошибки метода неизбежны, тогда как технические ошибки зависят главным образом от качества работы исследователя. Следует помнить, что статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке. Чашечный метод и метод предельных разведений требуют особой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки, пробирки и среды от заражения микроорганизмами из воздуха, так как каждая случайно попавшая клетка может заметно повысить число микроорганизмов в исследуемом субстрате.
1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД МИКРОСКОПОМ
Для подсчета клеток микроорганизмов под микроскопом можно использовать счетные камеры, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых). Основное ограничение большинства указанных методов – необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.
1.1 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского – Брида)
Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах – почве, загрязненной воде, оптически непрозрачных средах, содержащих нерастворимые в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться, поэтому подсчет можно производить в удобное для исследователя время.
1.1.1 Приготовление препарата
Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой размечен прямоугольник площадью 4 или 6 см². Затем на стекло наносят точно отмеренный объем исследуемой суспензии (обычно от 0,02 до 0,05 мл) и в некоторых случаях добавляют каплю 0,03…0,1%-го водного раствора агара. Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей по площади, отмеченной на миллиметровой бумаге. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют от 10 до 20 минут 96%-ным спиртом и окрашивают эритрозином, метиленовым синим или фуксином в течение двух минут. Затем препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4-5 сосудов с водой (промывать под проточной водой не следует), и высушивают на воздухе. В таком виде препараты хорошо сохраняются.
1.1.2 Правила подсчета
Препарат микроскопируют с иммерсионным объективом. При этом подсчитывают количество клеток в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Правила подсчета в квадратах окулярной сетки то же, что и в квадратах сетки счетной камеры. Чтобы результат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать в 50 – 100 квадратах сетки (не менее десяти полей зрения), передвигая препарат по диагонали. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток на всей площади поля зрения микроскопа. Общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
где М– количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата;
а– среднее количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s– площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мм²;
V– объем нанесенной на стекло суспензии, мл;
n– коэффициент разведения исследуемого субстрата.
Площадь квадрата сетки (поля зрения) определяют с помощью объективного микрометра, который помещают на столик микроскопа вместо препарата, и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, измеряют сторону квадрата сетки или диаметр поля зрения. Площадь поля зрения вычисляют по формуле s=πr².
1.2 Подсчет клеток в счетных камерах
Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях).
Известны счетные камеры разных конструкций (Горяева, Фукс — Розенталя, Петрова — Хауссера, Тома — Цейса и др.).
Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах проводится учет всех клеток микроорганизмов без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе от 8 до 40´.
В качестве примера можно привести камеру Горяева, которая внешне представляет собой толстое предметное стекло, разделенное поперечными бороздками, образующими три поперечно расположенные плоские площадки (рисунок 1 а). Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка. Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней, они служат для притирания покровного стекла (рисунок 1 б).
Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по-разному сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат АВСD (рисунок 1 в), сторона которого равна 1/20 мм, площадь его – 1/400 мм², а объем при высоте камеры 1/10 мм – 1/4000 мм³ или 1/4000000 мл. Так называемый большой квадрат АВСD состоит из 16 малых квадратиков. Камера Горяева имеет площадь 9 мм², объем камеры 9 мм³ и разбита на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду).
в– вид при малом увеличении; h– высота камеры
Рисунок 1 – Счетная камера Горяева
1.2.1 Заполнение камеры и подсчет клеток
Каплю взвеси наносят капилляром или пипеткой на сетку камеры
и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков распределиться по всей сетки, не выступая в желобок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления картины интерференции (колец Ньютона). Заполненную камеру помещают на предметный столик микроскопа и через 2 минуты микроскопируют с объективом от 8 до 40´ (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов). Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или 0,5%-ным раствором формалина.
Обычно просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:
где М– количество клеток в 1 мл суспензии;
a– среднее количество клеток в квадрате сетки;
S– площадь квадрата сетки, мм²;
10³ – коэффициент перевода [см³] в [мм³];
n– коэффициент разведения исследуемой суспензии.
1.3 Подсчет клеток на мембранных фильтрах
Данный метод рекомендуется использовать для определения численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток. Его применяют при определении количества микроорганизмов в различных водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других исследованиях. Фильтрование пробы известного объема (от нескольких миллилитров до литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.
1.3.1 Приготовление фильтра
Для фильтрования выбирают фильтр, размер пор которого позволяет задерживать микроорганизмы, находящиеся в субстрате. Перед использованием фильтры кипятят в дистиллированной воде для удаления воздуха и остатков растворителей; воду следует два или три раза сменить (кипячение не должно быть слишком бурным, иначе фильтры будут скручиваться). Затем фильтр помещают на специальный держатель матовой стороной вверх и пропускают через него точно измеренный объем пробы.
Чем больше плотность клеток в исследуемом материале, тем меньше должен быть исследуемый объем, и наоборот. Клетки микроорганизмов, осевшие на фильтре, окрашивают карболовым эритрозином. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную красителем, чашку закрывают крышкой и оставляют на время от 3 до 5 часов или на сутки. Для равномерного окрашивания клеток мембранный фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритрозином. Затем мембранный фильтр отмывают от красителя, перекладывая его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, обильно смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока он не перестанет ее окрашивать. После отмывания фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопии. На предметное стекло наносят каплю иммерсионного масла, помещают на него окрашенный мембранный фильтр так, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность мембранного фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и покрывают фильтр покровным стеклом.
1.3.2 Правила подсчета
Количество клеток микроорганизмов подсчитывают с иммерсионным объективом 90´ в квадратах окулярной сетки или в поле зрения микроскопа. Правила подсчета аналогичны тем, которые изложены для метода Виноградского – Брида. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
где М– количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата;
а– количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s– площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мм²;
F– площадь мембранного фильтра, мм²;
V– объем профильтрованной жидкости, мл;
106 – коэффициент перевода [мм²] в [мкм²].
1.4 Метод микрокультур
Метод позволяет получить быстрый ответ о биологическом состоянии объекта. Для получения микрокультур в центр стерильного предметного стекла с начерченной миллиметровой сеткой площадью
5 см² наносят определенный объем (0,05 мл) разведенной культуры. Сюда же прибавляют две или три капли питательной среды, расплавленной и охлажденной до 45 ºС, перемешивают ее с посевным материалом и размазывают по всей поверхности сетки. Полученный препарат накрывают покровным стеклом, кладут в стерильную чашку и ставят в термостат при температуре от 30 ºС до 37 ºС на 8 ч. Затем его вынимают, подсушивают и микроскопируют. Колонии можно подкрасить метиленовым синим Леффлера, разбавленным в соотношении 1:4. Окрашенный препарат снизу протирают, мазок накрывают покровным стеклом и подсчитывают колонии под микроскопом.
2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ВЫСЕВОМ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
2.1 Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха)
Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ). Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы, которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба.
Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.
2.1.1 Приготовление разведений
Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или в 0,85%-ном растворе NaCL (физиологическом растворе). В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.
Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды – это первое разведение (10-1). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 мл суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение (10-2). Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.
Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата вследствие высокой способности клеток микроорганизмов к сорбции на поверхности стекла.
Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом (рисунок 2) разливают расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри от 15 до 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхности агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушить для удаления конденсационной воды, например, поместив чашки в термостат на 2…3 суток крышками вниз.
Рисунок 2 – Схема приготовления разведений и посева суспензии микроорганизмов
В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают от двух до четырех параллельных высевов. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45…50 ºС среду, тщательно перемешивают, затем немедленно выливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2…4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15…20 мл среды, расплавленной и остуженной до 45…50 ºС, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.
Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего учета колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендуется осветлять.
2.1.3 Подсчет выросших колоний
Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1…15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.
Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
где М– количество клеток в 1 мл;
а– среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;
V– объем суспензии, взятый для посева, мл;
10 – коэффициент разведения;
n– порядковый номер разведения, из которого сделан высев.
2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)
Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений питательного субстрата. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата. Таким образом, определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.
2.2.1 Приготовление разведений
Разведения исходной суспензии готовят, как и для чашечного метода.
2.2.2 Посев и регистрация результатов
Стерильную среду предварительно разливают в пробирки (колбы)
и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из 4…5 последних, причем каждое разведение высевают в 3…5 повторностях (параллельных пробирках). Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных продуктов метаболизма.
Наиболее вероятное число микроорганизмов в единице объема рассчитывают по таблице Мак – Креди (таблица 1), разработанной на основании методов вариационной статистики.
Таблица 1 – Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии (по Мак – Креди)
число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок
число микроорганизмов при засеве параллельных
Продолжение таблицы 1
Продолжение таблицы 1
Для этого первоначально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число пробирок, в которых отмечен рост микроорганизмов при высеве из двух последующих разведений. Затем по таблице 1 находят наиболее вероятное число микроорганизмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.
2.2.3 Примеры расчета
Разведения исходной суспензии
Число засеянных пробирок
Число пробирок, в которых обнаружен рост
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии
Разведения исходной суспензии
Число засеянных пробирок
Число пробирок, в которых обнаружен рост
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии
3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВЗВЕШИВАНИЕМ
Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде, однако в этом случае микроорганизмы необходимо предварительно тщательно смыть с поверхности среды физиологическим раствором или водой и перевести в суспензию. Метод не может быть использован при культивировании микроорганизмов на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде.
Определение биомассы состоит из трех последовательных операций: доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения; отделение клеток микроорганизмов от культуральной жидкости; определение их массы. Чаще всего определяют массу сухих клеток, хотя иногда можно ограничиться определением сырой биомассы. В последнем случае первый этап отпадает; достаточно только взвесить пустую центрифужную пробирку (фильтр), но не доводить ее массу до постоянного значения. Биомассу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр культуральной жидкости.
3.1 Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения
С этой целью фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри или центрифужные пробирки (не пластиковые!), помещают в сушильный шкаф и высушивают в течение одного или двух часов при температуре от 80 до 85 ºС или от 90 до 100 ºС соответственно. Затем чашку Петри с фильтрами или центрифужные пробирки вынимают из сушильного шкафа и быстро переносят в эксикатор с безводным хлористым кальцием (СаСL2) или концентрированной серной кислотой. Эксикатор ставят около аналитических весов, на которых будет проводиться взвешивание. Через час фильтры (центрифужные пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание повторяют, соблюдая указанную последовательность операций, пока масса не достигнет постоянного значения, т. е. колебания в ее определениях не будут превышать десятых долей миллиграмма.
3.2 Отделение микроорганизмов от среды
В центрифужную пробирку наливают точно измеренный объем тщательно перемешанной жидкой культуры, который в зависимости от ее плотности колеблется от 5 до 20 мл. Время центрифугирования и число оборотов зависят от размеров клеток. Чем они меньше, тем больше требуется оборотов и тем продолжительнее должно быть время центрифугирования. Чаще всего центрифугируют от 15 до 20 мин при 3…5 тыс. g. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок промывают слегка подкисленной дистиллированной водой (1 мл концентрированной НСL на 1 л воды) и снова центрифугируют при том же числе оборотов. Супернатант сливают тотчас после остановки центрифуги. В противном случае часть осадка может быть потеряна.
Мицелий актиномицетов и грибов отделяют фильтрованием. Бумажный фильтр помещают в стеклянную воронку и фильтруют через него точно измеренный объем культуры — от 5 до 10 мл. Осадок на фильтре многократно промывают подкисленной дистиллированной водой.
Для отделения бактерий используют мембранные фильтры. Размеры пор мембранного фильтра должны быть меньше величины клеток, биомассу которых определяют. Мембранный фильтр помещают на пористую пластинку специального держателя, вставленного в колбу. Чтобы ускорить фильтрование, установку подключают к водоструйному насосу. Осадок несколько раз промывают подкисленной водой.
3.3 Определение биомассы
Чтобы определить массу сухих клеток, центрифужную пробирку или фильтр с осадком клеток микроорганизмов помещают в сушильный шкаф, высушивают и взвешивают. Режим высушивания и взвешивания тот же, что использовали и при определении массы пробирок или фильтров. Сухую биомассу определяют по формуле:
М =
где М– сухая биомасса, г/л;
А– масса центрифужной пробирки (фильтра) с осадком, г;
В– масса центрифужной пробирки (фильтра) без осадка, г;
V– объем культуральной жидкости, взятый для центрифугирования (фильтрования), мл.
4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И БИОМАССЫ НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Оптический (нефелометрический, турбидиметрический) метод определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости.
В основе метода лежит измерение ослабления светового пучка при его прохождении через суспензию клеток. В определенных пределах оно обусловлено преимущественно рассеянием света клетками и пропорционально их концентрации. Величина этого показателя зависит от многих факторов (формы и размеров клеток, оптических свойств культуральной среды, длины волны света и т. д.), поэтому нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений.
Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять число клеток по светорассеянию, должна быть оптически прозрачной.
Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют с помощью нефелометра, фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно в интервале от 540 до 650 нм), при которой поглощение света данной суспензией клеток минимальное. При высоких концентрациях клеток в культуральной среде происходит вторичное рассеяние света, что приводит к занижению результатов.
В некоторых случаях плотность клеточной суспензии выражают в показателях нефелометра. Однако чаще строят калибровочные кривые между величиной светорассеяния и числом клеток или сухой биомассой в единице объема. Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину оптической плотности суспензий с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют одним из применяемых методов количество клеток или биомассу. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс – количество клеток, содержащихся в 1 мл суспензии, или биомассу в г/л. Для каждого микроорганизма следует строить свою калибровочную кривую.
5 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
5.1 Лабораторная работа № 1. Методы определения общего количества микроорганизмов в сыром молоке (6часов)
Ознакомиться с различными методами бактериологического исследования молока по определению общего количества микроорганизмов.
1. Провести бактериологическое исследование различных проб молока: приготовить разведения 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1: 100000 и сделать посевы на мясопептонный агар (МПА) в чашках Петри.
2. Подсчитать общее количество микроорганизмов в различных пробах молока (свежего и длительного хранения) методом Брида.
3. Определить количество микроорганизмов в молоке косвенным методом (редуктазная проба).
4. Сделать учет результатов, их оценку и занести полученные данные в протокол.
Оборудование и материалы:
– стерильные пипетки на 1, 2, 10 мл;
– пробы молока (свежего и длительного хранения);
– водный раствор 2%-ной метиленового синего;
– колбы емкостью 150-250 мл.
Методические указания по теме
О санитарно-гигиеническом состоянии молока можно судить по загрязнению его механическими примесями, по количественному содержанию бактерий, характеру микрофлоры, кислотности, наличию возбудителей инфекционных заболеваний и т. д.
Для определения содержания микроорганизмов в молоке обычно применяют следующие прямые (метод посева на питательные среды; непосредственный подсчет микроорганизмов под микроскопом) и косвенные методы (редуктазная проба).
5.1.1 Определение общего количества бактерий в молоке методом посева
Вначале готовят разведения (10-1– 10-6), для чего из отобранной пробы молока стерильной пипеткой берут 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (технику приготовления разведений см. в п. 2.1.1). Далее из разведений 10-4, 10-5 и 10-6 берут отдельной стерильной пипеткой по 1 мл суспензии, вносят в стерильные чашки Петри, а затем вносят 10 мл расплавленного и охлажденного до 50 ºС МПА. Суспензию с агаром перемешивают и чашки Петри с посевом помещают в термостат при температуре 30 ºС. После двухдневной инкубации подсчитывают колонии бактерий в чашках. Для подсчета общего количества бактерий в 1 мл общее количество колоний, выросших в бактериологической чашке, умножают на соответствующее разведение.
5.1.2 Подсчет микроорганизмов в мазках из молока методом Брида
5.1.2.1 На предметном стекле восковым карандашом наносят квадрат площадью 2×2 см (400 мм² ).
5.1.2.2 Микропипеткой в центр квадрата вносят 0,01 мл испытуемого молока и равномерно распределяют его в пределах квадрата, т. е. готовят мазок с известной площадью.
5.1.2.3 Мазки подсушивают на воздухе, фиксируют и обезжиривают от 10 до 15 минут в спирт-эфире.
5.1.2.5 Проводят расчет количества микробов, содержащихся в одном миллилитре испытуемого молока:
– определяют, сколько полей зрения придется на площадь мазка, учитывая, что площадь поля зрения иммерсионного объектива равна 0,02 мм². Для этого площадь мазка делят на площадь иммерсионного объектива 400 мм²: 0,02 мм² = 20000 полей зрения;
– определяют сколько микроорганизмов содержится в мазке, приготовленном из молока: среднее количество бактерий, содержащихся в одном поле зрения иммерсионного объектива, умножают на количество полей зрения, укладывающихся в мазке (20000 полей зрения);
– так как мазок приготовлен из 0,01 мл молока, то в 1 мл их содержится в 100 раз больше.
5.1.3 Определение количества микроорганизмов в молоке
В молоке содержатся различные ферменты, в том числе редуктаза– анаэробная дегидрогеназа, катализирующая передачу водорода от окисляемого субстрата любому ненасыщенному соединению кроме кислорода воздуха. Редуктаза накапливается в молоке главным образом при размножении в нем микроорганизмов. Поэтому количество ее в молоке – показатель его бактериальной обсемененности. Обнаруживается редуктаза по обесцвечиванию красителей – метиленового синего или резазурина.
При редуктазной пробе с метиленовым синим добавляют реактив в молоко, отчего оно окрашивается в синий цвет. Редуктаза восстанавливает метиленовый синий, переводя его в бесцветную лейкоформу. Поэтому в присутствии редуктазы молоко, окрашенное метиленовым синим, обесцвечивается.
По скорости восстановления в молоке метиленового синего можно примерно определить численность бактерий и степень загрязнения молока. Однако строгой зависимости между числом бактерий в молоке и временем обесцвечивания в нем метиленового синего нет, так как каждый вид бактерий выделяет определенное, неодинаковое количество редуктазы.
Взятие пробы проводят после тщательного перемешивания молока. В чистую пробирку наливают 1 мл рабочего раствора метиленового синего и 20 мл исследуемого молока. Пробирку закрывают резиновой пробкой, перемешивают путем медленного переворачивания и ставят на водяную баню или термостат при 38-40 ºС. Изменения окраски в молоке учитывают через 20 мин, 2 ч и 5,5 ч. Проба на редуктазу считается законченной, когда наступает полное обесцвечивание молока. В зависимости от времени обесцвечивания метиленового синего молоко разделяют на четыре класса (таблица 2).
Таблица 2 – Определение качества молока по времени его
е) краситель сливают, препарат промывают водой, последовательно погружая стекло в 5 – 6 стаканов с водой) и высушивают на воздухе.Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами.Для получения достоверных результатов клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50 – 100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.
крывают фильтр покровным стеклом.где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); s и F – площадь квадрата окулярнойсетки (поля зрения) и мембранного фильтра в мм2, соответственно;V – объем профильтрованной суспензии в мл; 106 – коэффициент пе-ревода мм2 в мкм2.
